وبلاگ

1-1- شیر………………………………………………………………………………………………… 2 1-2- ترکیبات شیر………………………………………………………………………………………………………………… 4 1-3- پروتئین­های شیر…………………………………………………………………………………………………………. 5 1-3-1- پروتئین­های آب پنیر………………………………………………………………………………………… 6 1-3-2- کازئین­ها…………………………………………………………………………………………………………….. 7 1-3-3- کازئین­بتا…………………………………………………………………………………………………………….. 9 1-4- فعالیت­های زیستی کازئین­ها…………………………………………………………………………………….. 11 1-4-1- فعالیت چاپرون کازئین­های شیر…………………………………………………………………….. 11 1-4-2- پپتیدهای فعال زیستی……………………………………………………………………………………. 12 1-4-2-1- پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………………………………………. 12 1-4-2-2- منابع اصلی پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………………….. 12 1-4-2-3- برخی از خواص پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………….. 12 1-4-2-3-1- خاصیت ضد فشار خون……………………………………………………………… 12 1-4-2-3-2- فعالیت آنتی­اکسیدانی………………………………………………………………… 14 1-5- مشکلات ناشی از مصرف شیر در افراد…………………………………………………………………….. 15 1-5-1- عدم تحمل لاکتوز……………………………………………………………………………………………. 15 1-5-2- آلرژی به پروتئین­های شیر……………………………………………………………………………… 16 1-5-2-1- معرفی انواع آزمون­های رایج جهت مطالعه­ فرایند آلرژی……………… 18 1-5-2-2- آزمون الایزا……………………………………………………………………………………………. 19 1-6- قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین­ها……………………………………………………………………………. 20 فصل دوم: مروری بر پژوهش­های پیشین………………………………………. 23 فصل سوم: مواد و روش­های تحقیق 3-1- مواد مصرفی………………………………………………………………………………………… 27 3-2- تهیه­ محلول­ها……………………………………………………………………………. 28 3-2-1- تهیه­ محلول­های کازئینی، کازئین­بتا و تعیین غلظت آن­ها………………………. 28 3-2-2- تهیه­ محلول برادفورد و رسم نمودار استاندارد آن با استفاده از کازئین­بتا……………………………………………………………………………. 28 3-2-3- تهیه­ محلول­های مورد نیاز برای الکتروفورز ژلی………………………………………… 30 3-2-3-1-تهیه محلول SDS 20 درصد………………………………………………………………… 30 3-2-3-2- تهیه محلول آمونیوم پر سولفات (APS)……………………………………………… 30 3-2-3-3- تهیه محلول آکریلامید و بیس آکریلامید…………………………………………… 31 3-2-3-4- تهیه بافر تریس 5/1 مولار…………………………………………………………………… 31 3-2-3-5- تهیه بافر تریس 5/0 مولار…………………………………………………………………… 31 3-2-3-6- تهیه بافر تانک به حجم 500 میلی­لیتر……………………………………………… 31 3-2-3-7- تهیه بافر نمونه X2………………………………………………………………………………. 32 3-2-3-8- تهیه 100 میلی­لیتر محلول کوماسی­بلو……………………………………………… 33 3-2-3-9- تهیه محلول رنگ بر ژل………………………………………………………………………… 33 3-2-4- تهیه محلول OPA به حجم 50 میلی­لیتر……………………………………………………. 33 3-2-5- تهیه محلول فلورسامین…………………………………………………………………………………… 34 3-2-6- تهیه محلول ANS…………………………………………………………………………………………… 35 3-2-7- تهیه محلول ABTS رادیکال…………………………………………………………………………. 36 3-2-8- تهیه عصاره­ی ACE از پودر استون شش خرگوش……………………………………… 37 3-3-روش­ها………………………………………………………………………………………… 38 3-3-1- تخلیص کازئین­بتا شیرگاو……………………………………………………………………………….. 38 3-3-2- تخلیص هموگلوبین A از خون انسان……………………………………………………………. 39 3-3-3- تعیین میزان خلوص پروتئین با بهره گرفتن از SDS-PAGE…………………………… 40 3-3-4- تهیه پودر استون شش خرگوش…………………………………………………………………….. 40 3-3-5- قندی کردن کازئین­بتا و کازئین­های شیرگاو به روش غیرآنزیمی………………. 41 3-3-6- آزمون­های OPA و فلورسامین برای تایید فرایند قندی شدن غیرآنزیمی………………………………………………………….. 41 3-3-7- مطالعه­ فلورسانس ذاتی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی……………………. 42 3-3-8- مطالعه­ فلورسانس عارضی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی……………….. 43 3-3-9- مطالعه تغییرات ساختاری کازئین­های بتای قندی و غیرقندی، با بهره گرفتن از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………. 43 3-3-10- مطالعه­ فعالیت چاپرونی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی………………… 44 3-3-11- هضم کازئین­های شیرگاو و کازئین­بتای قندی و غیرقندی به وسیله­ آنزیم­ های تریپسین و کیموتریپسین پانکراس گاوی…………………………………. 44 3-3-12- مطالعه­ فعالیت آنتی­اکسیدانی کازئین­های شیرگاو کازئین­بتای قندی و غیرقندی…………………………………………………………………………. 45 3-3-13- مطالعه­ فعالیت مهار آنزیم ACE به وسیله­ کازئین­بتا قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آن­ها……………………………………… 47 3-3-14- مطالعه­ توان آلرژی­زایی کازئین­ها و کازئین­بتای قندی و غیرقندی……. 47 3-3-15- آزمون آماری…………………………………………………………………….. 48 فصل چهارم: نتایج و بحث 4-1- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت­های زیستی (چاپرونی، آنتی­اکسیدانی و مهار آنزیمACE ) و آلرژی­زایی کازئین­بتا………………………………. 50 4-1-1- تخلیص پروتئین کازئین­بتا………………………………………………………………………………. 50 4-1-2- تخلیص هموگلوبینA از خون انسان……………………………………………………………… 51 4-1-3- مطالعه فرایند قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا در حضور ماده­ احیا کننده………………………………………………… 52 4-1-3-1- مطالعه­ قندی شدن کازئین­بتا با بهره گرفتن از ترکیب OPA……………… 53 4-1-3-2- مطالعه فرایند قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا با استفاده از ترکیب فلورسامین…………………………………………….. 54 4-1-3-3- استفاده از ژل SDS-PAGE احیایی برای تایید فرایند قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا……………………………………………………………………………… 55 4-1-4- مطالعه­ فلورسانس ذاتی و عارضی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی…… 56 4-1-5- مطالعه ساختار دوم کازئین­های بتای قندی و غیرقندی با استفاده از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………………………………………………………. 58 4-1-6- مطالعه فعالیت چاپرونی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی………………………. 60 4-1-7- هضم آنزیمی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی با آنزیم­ های تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 62 4-1-7-1- تایید فرایند هضم آنزیمی با بهره گرفتن از ژلSDS-PAGE (15درصد) احیایی……………………………………………………………………………………………………… 63 4-1-7-2- مطالعه فعالیت آنتی­اکسیدان کازئین­های بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آن­ها………………………………………………………… 65 4-1-7-3- مطالعه خاصیت مهار آنزیم ACE به وسیله­ کازئین­های بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آن­ها………………………… 71 4-1-8- مطالعه آلرژی­زایی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آن­ها…………………………………………………………………………………………… 73 4-2- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت آنتی­اکسیدانی و آلرژی­زایی کازئین­های شیرگاو…………………………………………………………………………………………. 77 4-2-1- جداسازی و قندی کردن کازئین شیرگاو……………………………………………………….. 77 4-2-2- تایید فرایند قندی شدن کازئین­های شیرگاو……………………………………………….. 77 4-2-2-1- استفاده از ژل SDS-PAGE (12 درصد) برای تایید قندی شدن غیرآنزیمی…………………………………………………………………………………………….. 77 4-2-2-2- استفاده از ترکیب OPA برای مطالعه­ قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­های شیرگاو……………………………………………………………………………………………………… 78 4-2-3- هضم آنزیمی کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو با آنزیم­ های تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 80 4-2-4- مطالعه فعالیت آنتی­اکسیدان کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو و پپتیدهای حاصل از هضم آن­ها………………………………………………………………………………….. 82 4-2-5- مطالعه آلرژی­زایی کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آن­ها به وسیله­ دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین………….. 86 خلاصه­ی نتایج ………………………………………………………………………………. 90 نتیجه ­گیری نهایی……………………………………………………………………………………. 91 فهرست منابع و مآخذ 92 شیر شکل1-1- نمایی از ترکیبات موجود در شیر. 1-2- ترکیبات شیر جدول1-1- ترکیبات سازنده شیر جانوران مختلف بر حسب درصد. 1-3- پروتئین­های شیر اکثر پروتئین­های شیر در طول زمان شیردهی بوسیله­ سلول­های پوششی غدد PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)ی تولید و ترشح می­ شود. این سلول­ها علاوه بر پروتئین، ترکیبات دیگری مانند چربی (تری­آسیل گلیسرول[3] و دی­گلیسرول[4]) و کربوهیدرات (لاکتوز[5]) را نیز تولید و ترشح می­ کنند (Bouguyo و همکاران 2006، De Kruif و همکاران 2003). پروتئین­های شیر از نظر ارزش غذایی و فعالیت زیستی بسیار حائز اهمیت هستند و به دو گروه کازئین­ها (آلفا S1، آلفا S2، بتا و کاپا کازئین) و پروتئین­های آب­پنیر (آلفالاکتالبومین[6]، بتا لاکتوگلوبولین، سرم آلبومین[7] و ایمونوگلوبولین[8]) تقسیم می­شوند. کازئین­های شیر گاو 80 درصد و پروتئین­های آب­پنیر بین20 تا 45درصد کل پروتئین­های شیر انسان را تشکیل می­ دهند ( Kunz و همکاران 1990، Wong و همکاران 1996). شکل1-2- پروتئین­های تشکیل دهنده شیرگاو. 1-3-1- پروتئین­های آب­پنیر پروتئین­های آب­پنیر از نوع کروی هستند که حدود 20 درصد پروتئین­های شیر را شامل می شوند. از لحاظ ساختاری این پروتئین­ها دارای مقدار قابل توجهی مارپیچ­آلفا[9] در ساختارشان می­باشند. آمینواسید­های اسیدی، بازی، آبگریز[10] و آبدوست[11] به صورت نسبتا متعادل در طول زنجیره ی پلی­پپتیدی این پروتئین­ها وجود دارد. این پروتئین­ها در محیط آبی شیر به صورت محلول هستند (Evans، 1982). خرید اینترنتی فایل کامل : پروتئین­های آب­پنیر شامل بتالاکتوگلوبولین، آلفالاکتالبومین، ایمونوگلوبولین، آلبومین سرمی، لاکتوفرین[12] و لاکتوپراکسیداز[13] می­باشد که غلظت و درصد این پروتئین­ها در شیر نسبت مستقیم با نوع آب­پنیر شامل اسیدی با pH پایین تر از 1/5 و بازی با pH بالاتر یا مساوی 6/5، منبع شیر ( گونه­ حیوان)، زمان سال، نوع خوراک حیوان و مرحله­ شیردهی دارد (Pintado 2001). فعالیت­های زیستی مختلفی به پروتئین­های آب­پنیر نسبت داده شده است که از بین این فعالیت­ها، خواص ضد میکروبی این پروتئین­ها به میزان زیادی بررسی شده است (Clare وهمکاران 2003).